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BIOXL 猪口蹄疫亚O型一步法荧光RT-PCR诊断试剂盒说明书

2009-03-04 中国食品网 中食网 570

包括48 个扩增反应所需的试剂

请在使用前通读操作说明书

1. 试剂盒组成

■ 25 管 扩增反应试剂球 (Reagent Sphere; 4oC 保存)

■ 2 x 520 μl FMDVA-1 扩增反应试剂球溶液 (Sphere Diluent; -20oC 保存)

■ 2 x 25 μl 阳性对照 (Positive control; -20oC 保存)

■ 1 x 10μl Taq酶(Taq Polymerase; -20oC 保存)

保存条件

试剂球需置干燥剂中保存在4oC,已融解的试剂球则需保存在零下20oC。其他试剂需保存在零下20oC。使用前在冰上溶解各试剂并充分混合,不要旋涡振荡含酶的扩增反应试剂。

2. 操作程序

扩增反应试剂的准备

1. 计算所需的反应数量 (n)

2. 需要溶解的试剂球 = 0.5 x n

3. 每个试剂球需要 40 μl 试剂球溶液及0.4μl Taq酶。

4. 在冰上溶解试剂,并轻轻扣击充分混合 (不要旋涡振荡含酶的试剂)

反应的准备

1. 实验中除从样本中获得的RNA 模板外,我们还建议设置阳性和阴性(水)对照

2. 按照下表准备扩增反应试剂:

反应组分

每个反应体积

扩增反应试剂

20 μl

样品RNA

5 μl

总体积

25 μl

注意:

■ 实验时RNA 应放在冰上

■ 阳性对照建议加5 μl 试剂盒提供的阳性对照。

■ 建议PCR 过程中检测样本设置重复,以便得到可靠的实验结果

■ 为了验证阴性实验结果不是由于样本中存有PCR 抑制物而导致PCR 呈阴性反应,我们建议在测试样本中加1 μl 的阳性对照作为spiking 对照 (spiking control),同时进行PCR 反应。

PCR 循环:

数据收集位点(FAM染料)

ABI7700 ABI7300 其它仪器

1 个循环42oC 30 分钟 *

95oC 10 分钟*

5 个循环95oC 10 秒 *

45oC 30 秒*

72oC 60 秒*

40 个循环95oC 15 秒 *

58oC 60 秒* * *

( * 表示位点收集FAM读数)

3. 实验数据分析

阴性的实验结果有几个可能性:

1. 样本中不存在目的片段;

2. 样本中目的片段的量低于检测值;

3. 样本中存有 PCR 抑制物。

试剂盒中设计spiking 对照 (spiking control) 是为了确定没有发生PCR 抑制。

如果样本中加了阳性对照以后扩增结果的 Ct值接近40(或者接近阴性对照的Ct值),说明样本中存在PCR 抑制物,那幺此次阴性的实验结果就不能作为正确的结果,需要重新开始样本核酸的提取和PCR 扩增。

北京祥龙环宇生物技术有限公司
北京市朝阳区朝阳路财满街财经中心9号楼1单元702室 邮编100025
电话 010-65567512 传真010-65563420


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