鱼油中富含具有重要生理功能的DHA（二十二碳六烯酸）、EPA（二十碳五烯酸），故从鱼油中分离制备高度不饱和脂肪酸(PUFA)，引起国内外广泛重视。鱼油的开发利用关键，是对鱼油中DHA，EPA等PUFA进行分离制备，以去除色素、胆固醇、饱和脂肪酸等非必需成分。
目前，从鱼油中提取EPA、DHA的方法很多，各有优缺点。下面将主要介绍一下国内外提取EPA、DHA的方法。
1、尿素包合法
尿素包合法是一种较常用的多价不饱和脂肪酸分离方法，其原理是尿素分子在结晶过程中与饱和脂肪酸或单不饱和脂肪酸形成较稳定的晶体包合物析出，而多价不饱和脂肪酸由于双键较多，碳链弯曲，具有一定的空间构型，不易被尿素包合，紫苏油中ALA，鱼油中EPA与DHA都以甘油三酯的形式等几率分布，空间位阻较大，难以直接包合，我们的做法是将其转化为脂肪酸酯或脂肪酸的形式后再进行包合。再采用过滤方法除去尿素包合物，就可得到较高纯度的多价不饱和脂肪酸。
尿素包合法是采用乙醇作有机溶剂。乙酯化鱼油、尿素、乙醇按1：2：6的投料比例进行。
首先将200kg尿素加入到600kg乙醇溶剂当中。待完全溶解后，缓慢加入100kg乙酯化鱼油，控制温度不超过75℃在搅拌状态下包合30min：反应结束后，静止冷却至室温使尿素充分结晶，形成包合物。此时利用离心分离技术回收尿素，再将滤液进行乙醇回收、酸洗和水洗等过程除去溶液中的乙醇和残存的尿素，即可得到包合后的高不饱和脂肪酸乙酯浓缩液。(注：使用尿素试纸检测浓缩液中尿素是否完全除净)
对高不饱和脂肪酸乙酯浓缩液分别进行定性定量检测。经气相色谱分析，其中EPA和DHA含量可在60％以上；称量浓缩液约在4kg左右，即收率可达到40％以上。
2、低温冷冻法
根据脂肪酸混合物在过冷有机溶剂中溶解度的不同达到分离的目的。饱和脂肪酸在有机溶剂(常用丙酮)中的溶解度与碳链的长度成反比；而同一不饱和度的脂肪酿，碳链越长，溶解度越低；对同样碳链数目的不饱和脂肪酸，随双键数的增加，溶解度增加。而且低温条件下，这种溶解度的差异更加明显，所以在低沮下将脂肪酸混合物镕于有机溶剂中，通过过滤，就可以除去其中大量的饱和脂肪酸和部分低不饱和脂肪酿，使EPA和DHA的总含量达到30％左右。用此种方法分离，需有极低温的冷却设备，成本比较高。
3、金属盐沉淀法
利用饱和脂肪酸、低不饱和脂肪酸以及EN和DHA的金属盐在某种有机溶剂中溶解度的不同进行分离。饱和脂肪酸的金属盐比不饱和脂肪酸的金属盐在有机溶剂中的溶解度小，特别是在含5％水份的丙酮或乙醇中。其中钠盐、锂盐法应用最多，浓缩后得到的EPA和DHA总含量可达到70％~75％，
4、皂化—尿素包合法
EPA、DHA的初步纯化(皂化、酸化) 将溶有鱼油量的15％Na0H的工业酒精溶液与鱼油混合，同时加入少量硬脂酸，搅拌至肥皂大量出现，静置1h压滤，滤液冷藏过夜(也可以室温放置过夜)，再次过滤除皂，滤液以HCL调PH＝3，冷藏(或室温)放置过夜，过滤，分出少量饱和硬脂酸，滤液可减压回收70％溶液，浓缩液以水洗至中性，干燥得富含EPA，DHA制剂。也可以继续进行尿素包合纯化鱼油多烯脂肪酸。
二次纯化(尿素包合) 为了得到EPA、DHA含量更高的产品，进行二次纯化在上一步酸化过滤除去饱和硬脂酸之后所得到滤液中直接加入一定量的尿素，加热至溶解（≤70℃)，之后自然冷却至室温．过滤除去尿素包合物，滤液也可以置于冷柜过夜．再次过滤除去结晶，所得滤液可先回收部分溶剂．水洗油层至中性。干燥，即得产品。水洗液可回收乙醇。对尿素包合物加水加热溶解静置分层，分出上层油水洗，干燥得副产品(主要是低不饱和酸和一定量的不饱和脂肪酸)，尿素回收。
5、鱼油交酯化
在碱性催化剂存在时，通过用乙醇置换油脂中的甘油，制取脂肪酸乙酯．鱼油乙酯化的目的在于将鱼油中的高不饱和脂肪酸二十碳五烯酸(DA)和二十二碳六烯酸(DM)分离出来。
将100kg鱼油加温到72℃—76℃．在搅拌条件下加入40kg配制好的3.1N的NaOH—C2H5OH溶液进行酯化，反应30min左右，检测pH值如已达到13—14，副反应完全中止。此时加15.6kg配制好的1：1的C2H5OH—Hcl溶液进行酸化反应。控制温度在70℃以下酸化20min左右，然后关闭搅拌，静止沉陷20min后，放出下层甘油、水和盐分，取上层乙酯比鱼油转入下一工序。该步可得乙酯化鱼油110~120kg，经气相色谱分析，DAH+EPA纯度仅为30％左右。
6、真空蒸馏法
原理 尿素包合法浓缩的鱼油，EPA和DHA含量最高只能达到70％左右(实验室可达70％以上)，但是为了达到70％以上或更高的纯度，并起到脱色目的，则要进行高真空分子蒸馏工艺。其原理就是根据不同物质或同一物质中不同组分的沸点不同，而在不同温度上，即不同沸点或沸程下由低到高截取各阶段的不同馏分，从而达到高精度的分离提纯目的。
其次，由于边油中的色素分子要相对较大，在蒸馏时随温度的升高、物料的减少而逐渐沉积凝聚在容器底部或壁上，从而使被蒸溶出来物质颜色较浅，达到脱色目的。
操作方法 为达到更高的质量要求，将尿素包含所得的高不饱和脂肪酸乙酯浓缩液．在真空度低于100Pa的工艺条件下进行分子蒸馏。分别在180℃~190℃、190℃~200℃和200℃~215℃三个温度段上截取轻馏分、中间馏分和重组分。这样，就可以使重组分中的EPA和DHA纯度达到70％乃至更高。
7、综合法
综合法是盐析法、低温冷冻法、尿素包合法等方法的综合应用。
总脂肪酸(FA)的提取采用盐析法。具体工艺为：取1/4鱼油量KOH，溶于95％乙醇中，制成2％的乙醇液于烧瓶内，加入鱼油，在氮气流下加热回流20~90min，使完全皂化，皂化程度检查用硅胶G薄层层析法，以甘油三酯斑点消失判皂化完全。皂化液于室温静置4~12h，减压抽滤，除去饱和脂肪酸钾盐结晶。滤液于一定温度下静置24h，再抽滤，向滤液加鱼油量3~5倍量石油醚提取不皂化物，振摇、静置分层，除去石油醚层。下层液以4mo1．L-1盐酸或30％硫酸调PH至l~2，搅拌，静置后，收集上层液，得粗总脂肪酸，脱水后减压蒸馏(或通N2蒸馏)乙醇后，得总脂肪酸。
多烯脂肪酸(PUFA)的制取用尿素包合法，包合工艺为：以总脂肪酸重2~5倍量尿素，加入总脂肪酸(g)12倍量无水乙醇(m1)中，加热使溶解，在不断搅拌下加入总脂肪酸(如用尿素包合，总脂肪酸可不作脱乙醇处理)，加热(60~65℃)至溶液澄清，室温搅拌3h进行一次尿素包合，静置24h，抽滤，除去尿素包合物结晶。另取3倍量乙醇加半量尿素，搅拌(必要时加热)使镕解，与滤液合并。室温搅拌进行二次包合，静置6h，于一定温度放置24h．抽滤，滤液每100mL加水300mL、2mo1•L-1盐酸70mL．搅拌2h，静置后收集上层油样液，水洗数次后，以无水硫酸钠干燥，得多烯脂肪酸。
8、超临界萃取法
所谓超临界萃取就是用高温、高压下的CO2流体从原料中溶解要想分离的成品通过改变温度和压力，分离出目的物质。超临界CO2萃取法是经典萃取工艺的延伸和扩展，与传统的分离方法相比，有如下一些特点：
a)超临界CO2萃取结合了蒸馏和萃取的特点，既可按挥发度的差异也可按分子间亲合力的不同进行混合物的分离；
b) 由于CO2的临界温度为31.1℃，临界压力7.374MPa，所以操作温度较低，因而操作条件比较温和，而且CO2无毒、安全且本身是惰性气体，能限制高碳脂肪酸的自动氧化、分解和聚合；
c)操作简单，萃取、分离一步到位，能耗低；
d)抽提器压力很高，需要养护高压泵和回收设备，这是超临界CO2萃取的缺点。
超临界CO2萃取法能较好地按碳原子数为序分离鱼脂酸酯，却难于分离碳原子数相同．双键数不同的鱼脂酸酯。若将超临界CO2萃取法和其它的方法相结合，有希望提高EPA和DHA的纯度。例如超临界CO2萃取法和尿素包合法相结合，超临界CO2萃取法和精馏相结合等，EPA、DHA的含量可分别达到90％以上。
9、其他分离纯化方法
a).柱层析法：采用AgNO3的硅胶柱层析，所得EPA及DHA的含量在90％以上，且可获得一定量的产品，比较经济实用。但也存在缺点，如：洗脱剂安全性差、Ag+易污染制品、AgNO3的硅胶柱不能够再生、以及不适宜大规模操作等。
b).薄层层析法：采用4％AgNO3硅胶板，能得到77％的EPA和84％的DHA，但不能得到大量的产品，且重现性不好。
c).气相色谱法：日本目前已有专门用于脂肪酸气相色谱分离的大型玻璃柱，将高不饱和脂肪酸的甲酯作为试样，能够在较短的时间内，收集到高纯度的EPA和DHA。
d).高效液相色谱法：通过逆相分配法进行分离。原理是根据EPA及DHA以及其它脂肪酸在流动相和固定相中的分配系数不同。所用的担体有PAK-500/C18柱、 Permaphace ODS担体等。洗脱液有乙醇、四氢映喃等。目前日本已可以用大型的制备柱来进行生产制备高纯EPA和DHA。
目前从鱼油中分离制备PUPA的方法有10余种，但工业上大规模制备，主要采用低温法与尿素包合法。主要是由于其他方法受到产品纯度、生厂成本、产品安全性等因素的限制。