培育双孢菇三级菌种多以麦粒为原料，在实际生产中发现污染率较高，或出现异常现象，究其原因，就是菌种生产操作的不规范所致。现提出具体规范操作技术，供菇农朋友参考。
1.原料处理：牛粪破碎处理后过筛，按1∶1.2加水拌匀，堆积发酵，每天翻堆一次，约20天左右，牛粪粉变为褐色、具有正常发酵草料的清香气味，晒干备用。
无受潮的小麦，充分泡透后捞出，适当遮阴、通风，发现表皮发干时，轻喷细雾湿润，24小时后即可发芽，待麦芽长至1-2厘米时，即可使用。
如果有虫蛀麦粒，也可使用，但虫蛀后的麦粒有孔洞，淀粉易流出，所以，必须多清洗几遍；然后倒入pH值8-9的石灰水中，浸泡6小时后煮20分钟左右，至麦粒无白心时，捞出麦粒，冷水冲洗后即可。
2.基本配方：麦粒（以干品计）100公斤、牛粪粉30公斤、石膏粉1公斤、碳酸钙1.5公斤。
3.基质混合：将麦粒与牛粪粉按1∶0.2比例混合，并同时拌入其他辅料，注意使牛粪全部粘附到麦粒上，水分不足时适量喷水。剩余牛粪粉待用。
4.装瓶操作：一般小批量生产多不采用标准瓶，而利用酒瓶、葡萄糖玻璃瓶等，装瓶灭菌。为降低生产成本，可用500毫升输液瓶。先装一把牛粪粉在瓶底，约1-1.5厘米厚，再装麦粒，装瓶时稍蹾瓶，使麦粒至瓶肩以下1厘米处，然后，再装入1-2把牛粪粉，并用"L"形工具将之摊平、压实，之后塞入棉塞。
5.灭菌冷却：采用高压灭菌方法，压力维持在0.15兆帕，保持2-2.5小时。灭菌结束后，压力下降至零后，可取出料瓶，移入冷却室或接种室，室内提前3天清理干净，并喷洒百病傻溶液，料瓶降温至30℃时即可接种。
6.接种操作：室内喷洒一遍赛百09溶液后，将原种用75%酒精擦洗一次，打开接种净化机，10分钟后即可开始接种操作。每瓶（500毫升）原种可接40瓶以上。
7.发菌培养：培养室（棚）提前清理卫生，地面灌水，地毯式喷洒百病傻溶液，密闭2天后，地面撒施石灰粉，即可将接种后的菌种移入。发菌期间，尽量控制培养室温度在25℃左右，不超过28℃，安装水温空调的最低可降至22℃左右，一般农户不具备条件，可采用土法降温：发菌棚内地面上用砖码起20厘米高，铺上新塑料膜，将菌种瓶立式排入，灌入地下水，每天换水1-2次，即可使菌瓶内保持25℃以下。每3天左右喷洒一次药物以作预防，可采用百病傻与赛百09交替施用；发现有菇蚊类成虫时，随即喷施高效氯氰菊酯予以杀灭。
8.剔杂处理：接种后第三天，即开始检查剔杂，发现任何非双孢菇菌丝的菌瓶，随即移出室外，有链孢霉菌污染的，应用方便袋从上往下套住菌瓶，慢慢移出。对一般杂菌的污染，可喷施药物后将料倒出，晒干后再次利用；对链孢霉菌污染，应远离培养室倒料，并予焚烧或深埋，空瓶用70℃以上热水烫杀，洗净后再用。
9.暂时保存：约经35-45天，菌种完成发菌，暂时不用的菌种，应予低温存放，一般保持2℃-4℃条件即可。
10.质量检验：双孢菇的菌丝浓白、清晰，生长有力，呈扇形生长，绒毛状菌丝多、整齐，气生菌丝洁白；现在采用最多的"2796"属半气生型品种，其菌丝旺盛、一致；没有黄白色厚菌被；菌丝浓白粗壮，遇高温时微黄、可出现少量束状菌丝，上下均匀一致。
瓶内菌丝生长不健壮、呈散乱状态，或有"退菌"、断菌"现象，料转色、结块或干缩，出现白色、浅黄色圆形块状物或不规则暗斑，有杂菌和螨类滋生，无蘑菇香味，具漂白粉或腥臭味等，均为不合格菌种。若菌丝呈淡黄白色，且菌丝萎缩，生长无力，或生长中就有菌被形成，则为培养基较湿或较老的菌种；菌种瓶内上部菌丝收缩变干，下部菌丝生长尚好，为培养基过干，培养温度过高；如果生长不均匀，表明麦粒浸泡和预煮时间不够；若生长中菌丝渐变黄，表明培养温度过高；若菌种瓶内上方出现很厚的菌被，是生产性能差或生理性状老化的菌种，不宜使用。一直在高温条件下培养的菌种，播种后不易吃料，发菌慢。