通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。
[实验原理]
多聚酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）的原理类似于DNA的天然复制过程。在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。
1．变性：加热 使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链间的氢断裂而形成两条单链，即变性阶段。
2．退火：使溶液温度降至50-60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结全，即退火阶段。
3．延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5’→3’方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。
上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25-30个循环后DNA可扩增106-109倍。
典型的RCP反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲、dNTP、MgCl2、两个合成的DNA引物、耐热Taq聚合酶。
[实验仪器与设备]
1．PCR基因扩增仪
2．琼脂糖凝胶电泳系统
[实验材料]
1. DNA模板 2. 4种dNTP
3. 引物1和引物2 4. Taq酶
5. 琼脂糖 6. DNA Marker
7. tip 8.eppendorf管
9. 微量移液器
附试剂的配制：
1. 10×PCR缓冲液
500mmol/L KCl
100mmol/L Tris·HCl(Ph8.3,室温)
15mmol/L MgCl2
0.1% 明胶
2. 4×dNTP
10mmol/L dATP
10mmol/L dCTP
10mmol/L dGTP
10mmol/L dTTP
3. Taq酶 1u/μL
4. DNA模板 1ng/μL
5. 引物溶液浓度 10pmol/μL
[实验步骤]
1．在0.5ml Eppendorf管内配制25μL反应体系
反应物 体积/μL
ddH2O 11
10×PCR缓冲液 2.5
2.5mmol/L dNTP 2.0
25mmol/L MgCl2 1.5
引物1 1.0
引物2 1.0
模板DNA 5
Taq酶 1
混匀,加25μL石蜡油.
2.按下述程序进行扩增
① 94℃预变性 5min
② 94℃变性 1min
③ 52℃退火 1min
④ 72℃延伸 1min
⑤ 重复步骤②-④35次
⑥ 72℃终延伸 10min
3．琼脂糖凝胶电泳分析RCR结果
配制1.5%琼脂糖凝胶，取10μL扩增产物电泳。保持电流40mA.电泳结束后，用EB染色15min,紫外灯下观察结果。
[作业]
根据紫外灯下观察的结果，画出电泳示意图，并讨论PCR反应应注意的事项。
[实验安排]
6学时
1天内可完成，上午做PCR反应，下午做电泳检测。