[实验目的]
通过本实验学习DNA的限制性内切酶酶切反应的基本原理与实验技术。
[实验原理]
1.限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA 序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP 的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA 分子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4 至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5"- G↓AATTC-3"),有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA 片段(如Sma:5"-CCC↓GGG-3");有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA 片段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。 5"…G↓AATTC…3" →5"…G AATTC…3" ；3"…CTTAA↑G …5" →3"…CTTAA G…5"
2.DNA 纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA 或单链DNA 的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。若需要不同的盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1倍体积3mol/LNaAc 和2倍体积无水乙醇，混匀后置于-70℃低温冰箱内30 分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。
3.DNA 限制性内切酶酶切图谱又称DNA 的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。构建DNA 限制性内切酶图谱有许多方法。通常结合使用多种限制性内切酶，通过综合分析多种酶单切及不同组合的多种酶同时切所得到的限制性片段大小来确定各种酶的酶切位点及其相对位置。酶切图谱的使用价值依赖于它的准确性和精确程度。在酶切图谱制作过程中，为了获得条带清晰的电泳图谱，一般DNA 用量约为0.5-1μg。限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同,各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度(大多数为37℃)。对质粒DNA 酶切反应而言, 限制性内切酶用量可按标准体系1μg DNA 加1 单位酶,消化1-2 小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量,一般增加2-3 倍,甚至更多,反应时间也要适当延长。
[实验仪器与设备]
水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉,紫外透射仪,照相系统
[实验材料]
λDNA; 重组pBS 质料或pUC19 质粒; EcoRI 酶及其酶切缓冲液; HindⅢ酶及其酶切缓冲液;琼脂糖(Agarose)。
附试剂的配制：
1、 5×TBE 电泳缓冲液：见实验二。
2、 6×电泳载样缓冲液：见实验二。
3、 溴化乙锭：见实验二。
[实验步骤]
1.将清洁干燥并经灭菌的eppendorf 管(最好0.5ml)编号,用微量移液枪分别加入DNA1μg 和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2μl,再加入重蒸水使总体积为19μl,将管内溶液混匀后加入1μl 酶液,用手指轻弹管壁使溶液混匀,也可用微量离心机甩一 下,使溶液集中在管底。
2. 混匀反应体系后,将eppendorf 管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上）,37℃水浴保温2-3 小时,使酶切反应完全。
3.每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混匀,以停止反应,置于冰箱中保存备用。
4.制备琼脂糖凝胶分析内切酶酶切反应结果
配制1.5%琼脂糖凝胶，取10μl 酶解液与2μl 6×载样液混匀电泳。保持电压在60-80V，电流在40mA.电泳结束后，用EB染色20-25min,紫外灯下观察结果。
[作业]
根据紫外灯下观察的结果，画出电泳示意图，并讨论内切酶酶切反应应注意的事项。
[实验安排]
6学时
1天内可完成，上午做内切酶酶切反应，下午做电泳检测。