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脂溶性维生素的测定

2010-08-28 中国食品网 中食网 762

一、维生素A

目前维生素A都是合成的,来源:(1)从动物肝脏中得到;(2)从维生素前体而得到(维生素前体:主要指类胡萝卜素,主要是β-胡萝卜素)

维生素A的测定常用的方法有三氯化锑比色法、紫外分光光度法、荧光分析法、液相色谱法。

对于三氯化锑比色法适用于样品中含VA高的样品,方法简便、快速、结果准确,但是对维生素A含量低的样品,如每克样品中含510μg维生素A时,这时样品由于受其脂溶性物质的干扰,不应用比色法测定。

对于紫外分光光度法不必加显色剂显色,可直接测定维生素A的含量,对样品中含VA低的也可以测出可信结果,操作简便、快速。

1、维生素A的性质

因有许多不饱和链,故见光易分解;

在缺氧情况下,对热较稳定,对光特别敏感。如测强化奶粉时,速度要快,一般要求测定时间长短,因为时间长,见光时间长,见光分解,故测出的比出厂的含量要少;

对碱稳定;

2、测定步骤

样品用有机溶剂萃取脂类

样品可以根据脂肪的测定处理脂肪,即索氏抽提法,采用乙醚作提取剂,也可用热苯回流方法提取脂类。如果样品中含蛋白质和淀粉多的情况下可采用乙醚提取法。

⑵脂类的皂化

脂类有维生素和脂肪这两部分通过皂化(50%KOH、无水C2H3OH、热回流)把它们分开,得到一部分皂化物和一部分不皂化物。

皂化条件:

1C2H3OH︰脂类= 81

2KOH=脂量×皂化价(mg)×2.5

3)皂化温度与时间:70℃、30分钟

在皂化时可以加入抗氧剂连苯二酚和对苯二酚,防止氧化。

提取:不皂化物和皂化物经水、苯、乙醚萃取可得到不皂化物。

柱层析分离干扰物质

采用柱层析分离干扰物质,如果柱层析把β-胡萝卜素也洗脱下来,那么这时维生素A与β-胡萝卜素就是一个混合物,还要将它们分离开。如果样品中只有维生素A而不含β-胡萝卜素时,这时可直接定容。

维生素A与β-胡萝卜素分离:

吸附剂:8分中性Al2O32分碱性Al2O3混合,装柱

分离方法:a.2%丙酮石油醚洗β-胡萝卜素;

b.用乙醚洗VA

3、测定方法

SbCl3比色法

维生素ACHCl3SbCl3CHCl3→形成兰色物质→在620nm有最大吸光峰

这种兰色物质不稳定,很快褪色或变成其它物质,所以在分析时最好在暗室中进行,并且做标准曲线。

计算:每百克样品含VA的量= C×(V1/V2)×(100/W

C:从标准曲线上查得VA的量

V1CHCl3定容的量

V2测定所取样液体积

紫外分光光度法

a.原理:

VA为脂溶性的,测定VA时必须先将样品中的脂肪抽提出来进行皂化,萃取不皂化部分,在经柱

层析除去杂质等干扰物质,在紫外328nm下测定,求出含量。

b.方法

1提取及皂化

称样10.00g于烧杯中40ml水搅匀250ml分液漏斗中加氨水5ml加乙醇35ml

摇匀用乙醚抽提(每次40ml抽提三次)收集乙醚层10ml水洗乙醚层三次→水层再

30ml乙醚抽提一次合并所用乙醚用索氏法除乙醚→待瓶中乙醚除尽后30ml80%

KOH40mlC2H5OH→加0.8g焦性没食子酸83℃水浴30分钟(皂化脂肪)→冷却后移入

250ml分液漏斗中60ml40ml乙醚抽提三次→合并乙醚抽提液用水洗至中性

用索氏法除乙醚除去后用5ml石油醚溶解瓶中内容物然后移入刻度试管中

2)层析

在层析柱内装8cm高度中性氧化铝2cm高度碱性氧化铝及1cm无水硫酸钠以石油醚浸透装皂化后的样液慢慢于柱内→12ml石油醚洗试管洗液倒入柱内,活塞打开以每分钟为35滴左右的速度打开,当液面降到接近硫酸钠时5ml石油醚→随后用5ml洗脱液逐次洗涤。

层析柱上第一个黄色层析层,一般是β-胡萝卜素,此带在12%洗脱液前后洗去,收集于10ml容量瓶中直到流出物不呈黄色为止,此层可测β-胡萝卜素用,而VA一般在50%洗脱液洗出,用2ml刻度吸管收集1ml。吸约0.2ml于小试管中→加0.3ml25%三氯化锑→溶液如呈兰色→表明有VA存在,故0.5ml用石油醚定容10ml

3)样液测定

以石油醚为空白

4 )计算

VA(I.μ100G)=(E×106×2)/(1830×100×W)×(1000/0.3)

0.3 :每 0.3 μ g VA 相当于 1 I. μ

E消光值W样品重量(g

1830:石油醚中其消光值1%cm1830

I.μ):一个国际单位,维生素A相当于0.6μgβ-胡萝卜素。

4、试剂

50%KOH;⑵ 无水硫酸钠;⑶ 乙醚(不含过氧化氢);⑷ 石油醚;⑸ 苯;

45%C2H5OH(应不含醛类物质)

酒精中含醛类的检查方法:

首先配银氨溶液,在50%硝酸银溶液中加入浓氨水,直到氧化银沉淀又重新溶解为止,在小试管中加2ml银氨溶液,加35滴酒精,摇匀,加10%NaOH 1滴加热,若有银镜反应,表示乙醇中含有醛。

脱醛处理:

取乙醇2000mlAgNO32g振摇溶解NaOH 4g→振摇溶解过滤上清液蒸馏即可

2025% SbCl3CHCl3

先量取100mlCHCl3于广口瓶中,用减差法称取一定量的干燥SbCl3SbCl3易吸水,所以必需蒸馏重结晶后使用,一般用沙浴上加热。

二、维生素D

维生素D在鱼肝油和鸡蛋黄等食品中含量较多,一般成人不会缺VD,而婴儿容易缺乏。

1、操作步骤

提取

样品(奶粉)+水→混匀在NH4OH的作用下酪蛋白Ca盐溶解加入乙醇使脂肪球分离→乙醚、石油醚萃取得到脂质(其它样品可用索氏提取得到脂质)

皂化

在奶粉中脂溶性物质有VD、β-胡萝卜素、VAVE、甾醇、脂肪。

目前皂化有三种情况:

低温(室温)

中温(70℃±2℃)

高温(10015min

低碱

低碱

低碱

回收率不完全

回收率46%

回收率70%

低碱=脂肪︰KOH12.5的关系

另外在皂化时加抗氧化剂与不加抗氧化剂回收率不一样,加抗氧化剂的回收率高于不加抗氧化剂的回收率。

有人将上面的皂化条件互补,采用中温-高碱并加抗氧化剂,这样的回收率为96.8%,效果较好。

故皂化条件70℃±2℃高碱+抗氧化剂

萃取

除甾醇

甾醇在食品中含量较多,主要是通过柱子,这个柱子就是毛地黄皂甙。

甾醇+毛地黄皂甙沉淀

洗脱液用乙醚︰己烷= 15配制而成

甾醇︰毛地黄皂甙= 114用量

皂土柱层析

VDVA共存时,须用皂土柱层析除VAVA的分解产物。

测定方法有两种:

比色法:
维生素ACHCl3SbCl3CHCl3/乙酰氮形成橙黄色物质500nm下测定

紫外分光光度法

VD /乙醇 265 nm 下测定


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